閆丙建 苑豐  趙彩玲  劉肅

【摘要】

目的：研究真皮內(nèi)注射二甲氨基乙醇（DMAE）復(fù)合制劑（賽雷弗?）對(duì)亞急性衰老 大鼠皮膚膠原代謝及TGFβ1/smads 通道的影響。方法：30只Wistar大鼠隨機(jī)分入衰老勝利 鹽水組（A組）、衰老治療組（B組）、正常對(duì)照組（C組），每組10只。A、B兩組頸背部皮下注射D-半乳糖125mg/kg/d，連續(xù)42天。從第18天開始于A、B組大鼠臀背部分別注射生理鹽水和賽雷弗?1ml，每周一次，連續(xù)四周。每次治療后3天進(jìn)行活體皮膚聚焦纖維鏡檢測(cè)。42天處死所有大鼠，取注射藥物區(qū)域皮膚，觀察各組皮膚真皮厚度、膠原纖維密度和皮膚羥脯氨酸（HYP）含量的變化，RT-PCR法檢測(cè)皮膚組織TGFβ1、smad3、Ⅰ、Ⅲ型前膠原（colⅠ  colⅢ)mRNA表達(dá)量，以及免疫組化法檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和TGFβ1的表達(dá)。結(jié)果：衰老治療組與衰老生理鹽水組大鼠相比真皮厚度、膠原纖維密度、羥脯氨酸含量顯著增加，皮膚組織colⅠ、TGFβ1、smad3 mRNA表達(dá)量增加（P<0.05),而對(duì)olⅢ mRNA及PCNA表達(dá)量沒(méi)有影響。結(jié)論：真皮內(nèi)注射賽雷弗?可正調(diào)節(jié)衰老皮膚中成纖維細(xì)胞TGFβ1/smad3基因表達(dá)，促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白合成，增加衰老皮膚中膠原的含量和真皮厚度，具有抗衰老作用。

【關(guān)鍵詞】抗衰老；真皮內(nèi)注射；DMAE復(fù)合制劑（賽雷弗?）；TGFβ1/smads 通道

引言

目前DMAE作為一種新型成分具有可觀的抗衰老效果[1]，而臨床應(yīng)用DMAE均為外用品，其大劑量用藥不單增加其相應(yīng)的副作用和毒性，其安全性和有效性尚不能讓人滿意也增加了病人的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。所以在美學(xué)藥物領(lǐng)域，人們需要更為有效的和安全微創(chuàng)的DMAE基礎(chǔ)產(chǎn)品得需求也越來(lái)越強(qiáng)烈。

本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的DMAE復(fù)合制劑（賽雷弗? ，加拿大spacon公司）是一種專利產(chǎn)品，其主要成分為0.1%DMAE、多種氨基酸維生素，礦物質(zhì)微量元素及透明質(zhì)酸。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)試驗(yàn)大鼠皮膚組織學(xué)變化和基因水平來(lái)探究其調(diào)節(jié)膠原代謝、延緩皮膚衰老的作用機(jī)制，為DMAE復(fù)合制劑安全、有效的應(yīng)用于臨床提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料和方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：DMAE復(fù)合制劑、D-半乳糖；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒；其余試劑均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)儀器：共聚焦纖維鏡；超聲細(xì)胞粉碎儀儀；熒光定量PCR儀。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性6周齡（220±20）g Wistar大鼠30只，由青島市藥物研究中心提供。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組：30只年輕健康Wistar大鼠隨機(jī)平均分成衰老生理鹽水組（A組）、衰老治療組（B組）、正常對(duì)照組（C組）。

1.2.3動(dòng)物模型建立：A、B組頸背部皮下注射D-半乳糖125mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥42天，制作成大叔衰老模型[2]。C組大鼠頸背部皮下注射等量的生理鹽水。從注射D-半乳糖18天開始，脫去大鼠臀背部?jī)蓚?cè)毛發(fā)，于臀背部紋身標(biāo)記以直徑為3cm的圓形治療區(qū)域。A、B組大鼠于標(biāo)記區(qū)域內(nèi)皮膚真皮內(nèi)多點(diǎn)，均勻注射生理鹽水和DMAE復(fù)合制劑各1ml，每周1次，連續(xù)4周。

1.3實(shí)驗(yàn)標(biāo)本及取材方法：

第42天，麻醉后處死大鼠，沿文身標(biāo)記線內(nèi)側(cè)1mm處切取皮膚標(biāo)本，留取少量組織以10%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋切片擬作形態(tài)學(xué)觀察。其余部分，液氮無(wú)菌管凍存待測(cè)。

1.4指標(biāo)觀察：

（1）每次真皮內(nèi)注射治療后3天進(jìn)行活體皮膚共聚焦顯微鏡觀察大鼠真皮膠原纖維密度變化。

（2）組織學(xué)觀察：HE染色、masson染色觀察真皮厚度、膠原纖維形態(tài)及密度。

（3）免疫組化分別測(cè)定成纖維細(xì)胞PCNA及TGFβ1的表達(dá)。

（4）生化指標(biāo)：檢測(cè)HYP含量

（5）RT-PCR檢測(cè)皮膚colⅠ、colⅢ、TGFβ1、smad3 mRNA表達(dá)量，采用2一△△CT方法分析基因表達(dá)結(jié)果。

1.5組織學(xué)測(cè)量：

40倍鏡下于每張HE染色切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野留取圖片，masson染色、TGFβ1及PCNA免疫組化染色后400倍鏡下隨機(jī)獲取5個(gè)視野，IPP圖像分析軟件進(jìn)行真皮厚度、膠原纖維密度、TGFβ1累計(jì)光密度進(jìn)行定量分析，計(jì)算PCNA陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。各個(gè)測(cè)量指標(biāo)的每張切片取其平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

各組測(cè)量數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1皮膚共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果：可見衰老生理鹽水組大鼠皮膚膠原纖維逐漸變得稀疏；衰老治療組膠原纖維一開始呈現(xiàn)和衰老生理鹽水組類似的稀疏排列的膠原纖維，但隨著真皮內(nèi)注射次數(shù)的增加，膠原纖維排列漸趨致密，并伴有新生的毛細(xì)血管；而正常對(duì)照組膠原纖維排列致密均勻，前后無(wú)明顯變化（圖1）。

2.2組織學(xué)觀察：

HE染色及masson染色可見衰老治療、正常對(duì)照組大鼠皮膚較衰老生理鹽水組厚（描述用術(shù)語(yǔ)），且衰老生理鹽水組皮膚膠原纖維排列疏松，膠原纖維厚度變薄，膠原束細(xì)長(zhǎng)、斷裂、排列紊亂。圖2

2.3各組真皮厚度和膠原纖維面積的系統(tǒng)定量分析 測(cè)量結(jié)果示衰老生理鹽水組大鼠真皮厚度和膠原纖維面積顯著低于衰老治療、正常對(duì)照組，且衰老治療組的真皮厚度顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但是masson染色結(jié)果顯示衰老治療組皮膚膠原纖維面積與正常對(duì)照組大鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）表1、圖2、圖3.

2.4HYP含量：衰老治療與衰老生理鹽水組相比皮膚HYP含量顯著增加，但仍低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）結(jié)果見表2.

2.5免疫組化結(jié)果：衰老各組PCNA陽(yáng)性數(shù)量較正常對(duì)照組均減少（P<0.05），且衰老治療組與衰老生理鹽水組之間沒(méi)有差異（P>0.05）圖4，TGFβ1的累計(jì)光密度結(jié)果顯示衰老2組TGFβ1累計(jì)光密度均下降（P<0.05），但衰老治療組累計(jì)光密度較衰老生理鹽水組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）圖5.結(jié)果見表1.

2.6RT-PCR結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示衰老生理鹽水組與衰老治療、正常對(duì)照組大鼠相比colⅠ、TGFβ1、smad3 mRNA表達(dá)量均減少，但衰老治療組TGFβ1mRNA表達(dá)量仍顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），衰老治療、正常對(duì)照組colⅠ和smad3 mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，colⅢ基因表大量在三組之間沒(méi)有差異（P>0.05）表2.

3.討論

Mesotherphy療法作為一種簡(jiǎn)單、有效、微創(chuàng)的注射技術(shù)通過(guò)將藥物直接注射于需作用部位，具有顯效快，療效明顯，微創(chuàng)、恢復(fù)期短等優(yōu)點(diǎn)并能減輕傳統(tǒng)給藥方法所產(chǎn)生的副作用，目前根據(jù)Mesotherphy療法理念真皮內(nèi)注射作為一種新的治療技術(shù)被廣泛應(yīng)用于皮膚美容機(jī)機(jī)體塑形等[3]。

賽雷弗?是一種混合制劑，其主要成分為0.1%DMAE、復(fù)方氨基酸、多種維生素及礦物質(zhì)、微量透明質(zhì)酸。目前DMAE其具有即可抗衰老、面部提升和抗皺的療效而受到廣泛的關(guān)注，臨床研究發(fā)現(xiàn)3%DMAE凝膠外用具有良好的美容效果，包括改善額紋、眶周細(xì)紋、唇厚度和形狀，以及整個(gè)面部皮膚的外觀，但其毒副作用可使成纖維細(xì)泡空泡化[4]，而2.5%DMAE培養(yǎng)人類成纖維細(xì)胞亦可導(dǎo)致空泡的出現(xiàn)，這都被認(rèn)為是高濃度DMAE的細(xì)胞毒性所引起，濃度反應(yīng)研究顯示低于1mmol/L培養(yǎng)成纖維細(xì)胞通常無(wú)空泡化效應(yīng)[5]。最近研究表明0.1%DMAE+氨基酸溶液真皮內(nèi)注射可啟動(dòng)膠原蛋白合成過(guò)程并增強(qiáng)皮膚抗氧化能力，同時(shí)還可以有效減輕其細(xì)胞毒性[1,6]。健康年輕化的皮膚膠原纖維代謝需要多種原料，維生素、氨基酸、及礦物質(zhì)都是皮膚膠原合成所需要的原料。本著真皮內(nèi)注射療法的治療理念，本實(shí)驗(yàn)采用低濃度DMAE并添加多種皮膚需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合制劑真皮內(nèi)注射，以探究其作為一種新型抗衰老藥物的抗衰老效果及其機(jī)制。

長(zhǎng)時(shí)間高劑量注射D-半乳糖可導(dǎo)致細(xì)胞功能及代謝紊亂，形成過(guò)量的超氧陰離子自由基，加速機(jī)體衰老[2,7]。衰老生理鹽水組與正常大鼠相比出現(xiàn)體重減低，反應(yīng)遲緩，毛瑟枯黃，精神萎靡，免疫力降低；組織學(xué)上表皮、真皮變薄，皮膚膠原含量減少，膠原纖維疏松，排列紊亂。此外，衰老生理鹽水組大鼠皮膚Ⅰ型前膠原蛋白mRNA表達(dá)量及皮膚HYP含量減少。皮膚CT結(jié)果可見衰老生理鹽水組大鼠膠原纖維逐漸稀疏。以上數(shù)據(jù)表明D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠造模成功，可用于本項(xiàng)研究。

皮膚的老化現(xiàn)象的出現(xiàn)主要體現(xiàn)在真皮膠原代謝的改變[8]。真皮膠原蛋白主要由Ⅰ、Ⅲ型組成，而健康成人皮膚Ⅰ型膠原纖維中占80%[10]。皺紋形成、彈性降低、皮膚干燥、色素沉積及紅斑都與真皮膠原纖維分解和萎縮及其體現(xiàn)在空間結(jié)構(gòu)上的真皮厚度、Ⅰ、Ⅲ型膠原比例導(dǎo)致及息息相關(guān)[8,9]。真皮內(nèi)注射DMAE復(fù)合制劑可增加衰老治療組大鼠皮膚真皮厚度、HYP含量，但是尚不能恢復(fù)到年輕大鼠水平，此外皮膚共聚焦顯微鏡觀察顯示衰老治療組皮膚膠原纖維密度出現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。DMAE復(fù)合制劑亦可使衰老大鼠膠原纖維密度、colⅠmRNA表達(dá)量顯著增加并達(dá)到年輕大鼠水平，colⅢmRNA表達(dá)量在三組大鼠皮膚沒(méi)有明顯變化，但是衰老大鼠皮膚colⅠ、Ⅲ比例明顯降低。由此我們推測(cè)：DMAE復(fù)合制劑可以促進(jìn)衰老大鼠成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白而發(fā)揮其抗衰老效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞PCNA的表達(dá)在衰老治療組與衰老生理鹽水組之間無(wú)明顯差別，提示真皮內(nèi)注射DMAE復(fù)合制劑不能誘導(dǎo)衰老大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖，無(wú)細(xì)胞過(guò)度增殖產(chǎn)生變異和癌變的隱患。

皮膚膠原蛋白主要由皮膚成纖維細(xì)胞分泌合成，所以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的與抗皮膚衰老密切相關(guān)。研究表明膠原蛋白的降解與合成與皮膚皮膚多種細(xì)胞因子有關(guān)。TGFβ1作為組織纖維化的調(diào)控者，通過(guò)活化下游smads信號(hào)通路，參與組織細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化、重塑、傷口愈合等過(guò)程，在器官的纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和調(diào)節(jié)膠原酶活性過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)，中和TGFβ1抗體和敲除smad3的大鼠都可通過(guò)抑制膠原合成和纖維化相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)一直纖維化效應(yīng)，而增加TGFβ1和smad3的表達(dá)可促進(jìn)膠原合成[15-17]。由此推斷smad3是TGF-β/Smads致纖維化信號(hào)傳導(dǎo)通路中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。TGFβ1通過(guò)磷酸化smad3，使之作為重要的調(diào)控因子直接調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞中的纖維化基因（ColIa1,ColIa2,ColVa2,ColVIa1,and ColVIa3、TIMP-1)發(fā)揮其生物學(xué)作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)真皮注射DMAE復(fù)合制劑可致衰老治療組大鼠真皮成纖維細(xì)胞中TGFβ1、smad3mRNA的表達(dá)量較衰老族顯著增加，且smad3基因表達(dá)量在B、C兩組間沒(méi)有差異，但是TGFβ1基因及蛋白表達(dá)量尚不能達(dá)到正常年輕大鼠皮膚的水平。以上研究表明DMAE復(fù)合制劑在基因水平上增加TGFβ1/smad3的表達(dá)量，從而進(jìn)一步促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白合成產(chǎn)生抗衰老效果。

4.小結(jié)

總之，本實(shí)驗(yàn)真皮內(nèi)定位定量注射DMAE復(fù)合制劑可有效減緩皮膚衰老，且不會(huì)導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖變異，具有一定的安全性。其抗衰老機(jī)制主要與增加Ⅰ型膠原蛋白合成及改善真皮結(jié)構(gòu)有關(guān)，而Ⅰ型膠原蛋白合成與正調(diào)節(jié)TGFβ1/smads通路分子表達(dá)量密切相關(guān)。

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圖1 皮膚共聚焦顯微鏡下3組大鼠膠原纖維的變化

圖2HE染色下3組大鼠皮膚真皮厚度的差異

圖3 masson染色觀察3組大鼠皮膚真皮膠原纖維密度的差異

圖4 免疫組化檢測(cè)3組大鼠皮膚PCNA表達(dá)量的差異

圖5免疫組化檢測(cè)3組大鼠皮膚TGFβ1表達(dá)量差異

表1

表2

△代表方差齊，*表示于衰老組相比P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，#表示衰老治療組與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。