王幕¹ 周志鋼¹ 董肇楊³ 唐雪鴻⁴ 曾勇³ 朱麗倩¹

武警上海市總隊醫(yī)院院級課題

【摘要】

放射性損傷創(chuàng)面作為一種難治性創(chuàng)面，其愈合過程由多種細胞因子參與調控，并發(fā)揮不同的生物學效應。但目前對于難愈性創(chuàng)面愈合的研究多采用單一的細胞因子，雖可取得一定的效果，但作用時間短、作用機制單一、療效不穩(wěn)定，副作用大。羥基乙酸共聚物（PLGA）為骨架材料包裹效應分子制成微球制劑，無毒、可降解和生物相容性好，可在有效時間點釋放發(fā)揮作用，是目前基因治療的新型載體，本研究利用PLGA載體轉入促進創(chuàng)傷愈合的多種生長因子，采用小鼠放射性損傷創(chuàng)面的模型，研究其在修復難治性創(chuàng)面的效果，為探索難治性創(chuàng)面的愈合機制及治療難題提供新的思路和治療措施。

背景：放射性損傷創(chuàng)面的愈合過程由多種細胞因子參與調控，并發(fā)揮不同的生物學效應，利用PLGA載體轉入促進創(chuàng)傷愈合的不同生長因子，是促進此難愈創(chuàng)面愈合的有效措施。

目的：研究VEGF、bFGF納米微囊復合體對放射性損傷創(chuàng)面愈合的影響。方法：以PLGA為支架聯(lián)合應用VEGF、bFGF構建納米微囊，作用于小鼠放射性損傷創(chuàng)面作為實驗組，未用VEGF、bFGF的做為對照組，觀察兩組創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面的病例改變；于傷后不同時間檢測創(chuàng)面新生血管細胞數(shù)目、毛細血管截斷面積及成纖維細胞數(shù)量；RT-PCR檢測創(chuàng)面VEGFmRNA、bFGFmRNA的表達水平；觀察其對放射性創(chuàng)面愈合的影響。結果：對于放射性損傷的小鼠創(chuàng)面，應用bFGF、VEGF構建納米微囊后，其創(chuàng)面愈合明顯高于對照組；實驗組中的創(chuàng)面組織中VEGFmRNA、bFGFmRNA的表達均高于對照組，兩組之間比較具有顯著性差異（P<0.05）；對創(chuàng)面組織HE染色，發(fā)現(xiàn)實驗組肉芽組織增多增厚，成纖維細胞數(shù)量級密度均高于對照組；傷后第8天、第15天，實驗組的新生毛細血管數(shù)量及毛細血管橫截面積均較對照組有所增加，實驗組的成纖維細胞計數(shù)明顯高于對照組，兩組之間比較均具有顯著性差異（P<0.05）。結論：VEGF、bFGF納米微囊復合體可以明顯促進小鼠反射性損傷創(chuàng)面的愈合。

【關鍵詞】血管內皮生長因子；堿性成纖維因子；納米微囊；放射性損傷；創(chuàng)面愈合

1.引言

放射性物質所導致的慢性創(chuàng)面損傷與普通的損傷不同，射線可穿透深部組織，引起創(chuàng)面延遲愈合，是臨床上難以處理的問題^[1]。研究表明不同的生長因子，尤其是促進血管再生的細胞分子如血管內發(fā)生長因子（VEGF）、堿性成纖維因子（bFGF）、血小板衍生因子（PDGF）等，在組織修復、創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要作用^[2-3]。但在發(fā)射型損傷的創(chuàng)面中，上述細胞因子表達降低。近年來研究^[4]發(fā)現(xiàn)聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）做為特殊的載體支架結合促進創(chuàng)傷愈合的細胞因子如bFGF或VEGF等可以促進創(chuàng)傷愈合。考慮到床上愈合過程中在不同階段涉及到多種細胞因子，為此我們以PLGA為支架，聯(lián)合應用bFGF、VEGF，觀察其對放射性損傷創(chuàng)面愈合的作用，為臨床上治療放射性損傷特供新的思路。

2.材料與方法

2.1設計：以動物創(chuàng)面為觀察對象，進行對比觀察

時間及地點：實驗于2013年8月至2014年10月在武警上?？傟犪t(yī)院及第二軍醫(yī)大學免疫研究所共同完成

2.2材料

2.2.1實驗動物：取48只體重（22±4）g健康雄性4-6周齡的C57BL/6小鼠由上海第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

2.2.2方法：

VEGF/bFGF-PLGA的制備

將25mgPLGA、25mgPluronic F-127溶解在2ml二氯甲烷中職稱有機相。300ng VEGF、300ngbFGF、4ug肝素鈉和200ug人血清白蛋白加入水中制成200ul的水相。有機相與水相渦旋30秒混勻，形成油包水的乳劑。在磁力攪拌下將這個油包水的乳劑注入到25ml乙醇中。所得到的懸浮液用25ml水稀釋。將上述液體在30℃溫度下旋轉揮干，此納米粒便濃縮在水相介質中。沒有載藥的納米粒制備時在水中未加入VEGF和bFGF，余方法同上。采用25kGyCo60照射滅菌，低溫保存。

實驗動物及分組

取48只體質量（22±4）g健康雄性4-6周齡的C57BL/6小鼠，將小鼠按6Gy 60Co-r射線進行一次性全身輻射建立輻射損傷動物模型。小鼠采用全麻后，于無菌條件下在小鼠背部致1cm×1cm全層皮膚缺損傷口，創(chuàng)面不予縫合，以單純沒有載藥的PLGA覆蓋創(chuàng)面小鼠做為對照組(24只），載有VEGF和bFGF-PLGA覆蓋創(chuàng)面的小鼠做為實驗組（24只），兩組小鼠創(chuàng)面均以TegadermTM貼膜包扎傷口，傷后小鼠自由飲食，隔日換藥，分籠飼養(yǎng)。

2.3創(chuàng)面愈合率比較

小鼠建立創(chuàng)面后當天采用TegadermTM貼膜覆蓋創(chuàng)面，在透明膜上沿創(chuàng)面邊緣描記，然后用Image Proplusv 1.5分析圖像軟件，測量創(chuàng)面面積作為傷口原始面積。采用同樣方法在傷后第4、8、15天測量傷口殘余面積，創(chuàng)面愈合率（%）=（1-殘余面積/原始面積）×100%

標本取材病例監(jiān)測

在兩組小鼠致傷后7天以過量麻醉藥物至死后取創(chuàng)傷創(chuàng)面組織，包括傷口周圍部分正常皮膚和創(chuàng)面下方的薄層肌肉組織，采用4%多聚甲醛溶液內固定，石蠟包埋，做成組織切片，常規(guī)H-E染色，觀察兩組病理區(qū)別。

創(chuàng)面新生毛細血管數(shù)目、毛細血管截斷面積及成纖維細胞計數(shù)

在兩組小鼠（每組24只），分別在致傷后4天、8天、15天（每個時間點八只），處死小鼠后，取創(chuàng)面組織，同上述方法做成組織切片，每張切片在高倍（400×10）顯微鏡下隨機選取10個視野，計數(shù)新生毛細血管、成纖維細胞數(shù)目，計算毛細血管截斷面積，分別取其平均值。

Real-timePCR檢測組織中VEGF、bFGFmRNA表達

在兩組小鼠致傷2周后，每組取八只，取局部創(chuàng)面組織，按試劑盒說明步驟提取總RNA，紫外分光光度儀測A260/A280值，并計算RNA濃度。反轉錄獲得cDNA文庫，采用SYBR PT-PCR試劑盒和StepOneTM實時定量PCR定量檢測系統(tǒng)進行測試。以標本內GAPDH mRNA做為細胞內mRNA表達的基準，1代表對照組標本內目的基因表達水平，依照2-△△Ct方法進行評估，對實驗組標本內測試基因表達水平進行標準化比對。所有檢測均進行三次獨立的重復操作。

2.4統(tǒng)計學分析

相關數(shù)據錄入SPSS16.0統(tǒng)計軟件，進行統(tǒng)計分析，其中如P<0.05則認為兩組間存在統(tǒng)計學上的差異。采用均數(shù)±標準差（x±s）方式表示所有相關數(shù)據。采用單因素方差分析的統(tǒng)計學方法進行組與組之間比較分析。

3結果

3.1放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA后創(chuàng)面愈合率與對照組比較

表1：兩組在創(chuàng)傷后不同時間點創(chuàng)面愈合率比較

*P<0.05

如表1顯示，放射性損傷創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA后，在傷后不同時間點（術后第4天，第8天，第15天）未應用VEGF、bFGF的對照組比較，在傷后第4天，治療組的創(chuàng)面愈合率要大于對照組，但兩者之間比較未見顯著性差異。治療組在傷后第8天及第15天，創(chuàng)面愈合率要高于對照組，兩組之間比較具有顯著性意義（P<0.05）。

3.2

放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA15天后創(chuàng)面（實驗組）與對照組比較，選取放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA與未用VEGF/bFGF-PLGA的對照組小鼠，在創(chuàng)傷后15天分別取創(chuàng)面組織，觀察創(chuàng)面組織中VEGF、bFGFmRNA的表達，結果（如圖1顯示）發(fā)現(xiàn)實驗組中的創(chuàng)面組織中VEGFmRNA、bFGFmRNA的表達均高于對照組，兩組之間比較具有顯著性差異（P<0.05）。

圖1：放射性損傷創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA15天后與對照組兩組間VEGFmRNA、bFGFmRNA表達的比較

3.3病理組織學結果

在致小鼠放射性創(chuàng)傷后7天，以小鼠創(chuàng)面給予未截細胞因子的納米顆粒處理的做為對照組，VEGF/bFGF-PLGA納米顆粒覆蓋創(chuàng)傷面的小鼠做為實驗組，取創(chuàng)面組織做常規(guī)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)：如對照組圖中所示，創(chuàng)面肉芽組織層偏薄，新生的毛細血管較少，成纖維細胞少；采用VEGF/bFGF-PLGA的實驗組中，肉芽組織增多增厚，成纖維細胞數(shù)量及密度均高于對照組。

3.4

放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA后創(chuàng)面（實驗組）與對照組的創(chuàng)面新生毛細血管數(shù)目及毛細血管橫截面積比較

如圖2顯示，在傷后第4天，應用VEGF/bFGF-PLGA的實驗組創(chuàng)面新生毛細血管計數(shù)及毛細血管橫截面積均高于對照組，但兩組之間未見顯著性差異（P>0.05），在傷后第8天、第15天時，實驗組的新生毛細血管數(shù)量及毛細血管橫截面積均較對照組有所增加，兩組之間比較均具有顯著性差異（P<0.05）。

圖2：放射性損傷創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA后，實驗組與對照組兩組間毛細血管計數(shù)及毛細血管橫截面積的比較

3.5

放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA后創(chuàng)面（實驗組與對照組的創(chuàng)面成纖維細胞計數(shù)比較

如圖3顯示，在傷后第4天，應用VEGF/bFGF-PLGA的實驗組創(chuàng)面的成纖維細胞計數(shù)要略高于對照組，但兩組之間未見顯著性差異（P>0.05），而傷后第8天、第15天時，實驗組的成纖維細胞計數(shù)明顯高于對照組，兩組之間比較均具有顯著性差異（P<0.05）。

圖3：傷后不同時間點，放射性損傷創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA的實驗組與對照組的成纖維細胞計數(shù)比較

4.討論

臨床放射性治療、核輻射等所導致的組織損傷，局部組織損傷嚴重，細胞生存環(huán)境變化大，尤其是當這一類病人在合并全層皮膚組織創(chuàng)傷及深層組織損傷時，其傷口的愈合及其困難，甚至形成難愈性創(chuàng)面，給患者的生活和經濟帶來很大的負擔。研究表明放射性損傷愈合困難的主要原因在于創(chuàng)傷早期炎性反應削弱、成纖維細胞和上皮細胞增殖減少；后期肉芽組織及膠原基質產生減少，使上皮化減慢。^[5]

近年來的研究表明在促進放射性損傷創(chuàng)面愈合方面，不同生長因子在創(chuàng)傷愈合的不同階段發(fā)揮著重要的作用^[6-7]。創(chuàng)傷的組織修復及愈合過程中包含著諸多如細胞的分裂及遷移、合成新的基質、新生的血管形成、新生的上皮細胞等細胞參與的活動^[8-9]。但細胞生長因子在創(chuàng)面促愈的過程中均存在著半衰期短的問題，需要特定的保護劑和良好的投遞系統(tǒng)的存在才能發(fā)揮作用，同時創(chuàng)面中所包含的間充質細胞及炎癥細胞也通過其釋放到創(chuàng)面組織中的酶，降解發(fā)揮促進愈合的細胞因子，使其發(fā)揮的作用大大學削弱^[10-12]?；谏鲜鲈?，因此需要特殊的載體物質使發(fā)揮作用的生長因子持續(xù)作用于創(chuàng)口，才能更有力于創(chuàng)面修復。近年來的一些研究結果^[15-17]表明，利用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球做為新型的載體混合生長因子制成復合緩釋劑，不僅具有無毒、可生物降解和生物相容性好等特征，而且其降解的時間可受分子量和聚合物含量比例的調節(jié)，很大程度上保持了生長因子的活性和持續(xù)釋放，真正達到了加速創(chuàng)面的愈合、提高其愈合質量的目的。

慢性放誰像你個損傷創(chuàng)面的修復比較復雜，肉芽組織增生是其中重要一環(huán)，其主要由新生毛細血管及成纖維細胞組成。研究發(fā)現(xiàn)促進血管生成及成纖維細胞生成的細胞因子，可以加速創(chuàng)面愈合。^[16]血管內皮生長因子（VGEF)特異性地與血管內皮細胞作用，并可使序貫的通透性增加，血漿蛋白滲出到血管周圍的間隙中，滲漏到血管周圍的纖維蛋白原會轉化成纖維蛋白，促進血管形成并不斷擴大生長。^[17]堿性成纖維因子（bFGF）是一組多肽，其生物學活性比較廣泛，其可作用于血管內皮細胞，促進其有絲分裂，誘導血管內皮細胞分泌某些蛋白酶，溶解并侵入周圍基質，進而形成毛細血管；同時促進內皮細胞及成纖維細胞向創(chuàng)面遷移，加速創(chuàng)面的愈合。^[18]

本實驗通過構建小鼠的放射性損傷模型，以PLGA為支架，聯(lián)合應用bFGF、VGEF，觀察VEGF/bFGF-PLGA在放射性損傷創(chuàng)面愈合中的作用及可能機制。研究發(fā)現(xiàn)在放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA15天后，創(chuàng)面組織中VGEF、bFGFmRNA的表達明顯升高，同時治療組在傷后第8天及第15天，創(chuàng)面愈合率要高于對照組，兩組之間比較具有顯著性意義（P<0.05），提示在放射性損傷創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA后，創(chuàng)面可以持續(xù)地高表達bFGF和VGEF，進而促進創(chuàng)面的愈合。

通過本實驗對放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應用VEGF/bFGF-PLGA后的病理分析發(fā)現(xiàn)，應用VEGF/bFGF-PLGA第8天及第15天后，實驗組的新生毛細血管數(shù)量及毛細血管橫截面積均較對照組有所增加，兩組之間比較均具有顯著性差異（P<0.05）；同時實驗組的成纖維細胞計數(shù)也明顯高于對照組，兩組之間比較（P<0.05），均具有顯著性差異。上述研究進一步說明VEGF/bFGF-PLGA促進創(chuàng)傷愈合的機制可能在于其使放射性損傷創(chuàng)面的肉芽組織中bFGF、VEGF的mRNA表達升高，使bFGF、VEGF發(fā)揮共同的作用，促進了創(chuàng)面新生血管的生成及成纖維細胞的增殖，改善了創(chuàng)面的血液循環(huán)，從而使創(chuàng)面愈合速度加快，促使放射性損傷創(chuàng)面愈合。本實驗的研究為豐富難愈傷口的理論提供了一定的實驗基礎，并為治療放射性損傷創(chuàng)面提供了新的思路。

參考文獻：

1、Olascoaga A,Vilar-Compte D,Poitevin-Chacon A,et al.Wound healing in radiated skin:pathophysiology and trend opinions.Int Wound J,2008;5:246-257.

2、Jia J,Dellinger AE,Weiss ES,et al.Direct Evidence of Target Inhibition with Anti-VEGF,EGFR,and mTOR Therapies in a Clinical Model of Wound Healing.Clin Cancer Res.2015 Apr 15.[Epub ahead of print]

3、Li W,Lan Y,Cuo R,et al.In vitor and in vivo evaluation of a novel collagen/cellulose nanocryatals scaffold for achieving the susained release pf basic fibroblast growth factor.J Biomater Appl.2015;29(6):882-93.

4、Shen T,Pan ZG,Zhou X,et al.Aceelerated healing of diabetic woud using artificial dermis constructed with adipose stem cells and poly (L-glutamic acid)/chitosan scaffold.Chin Med J(Engl).2013;126(8）：1498-503.

5、蔡金玲、杜麗、崔玉芳 放創(chuàng)復合傷創(chuàng)面難愈機制及治療的研究新進展。感染、炎癥、修復。2013；14（1），54-57.

6、Schultz GS,Wysocki A.Interactions between extracellular matrix and growth factors in wound healing .Wound Repair Regen .2009;17(2):153-162.

7、Raja,Sivamani K,Garcia MS,et al.Wound re-epithelialization:modulating keratinocyte migration in wound healing.Front Biosci.2007;12:2849-2868.

8、Gilliver SC,Wmmerson E,Bernhagen J,et al.MTF;a key palyer in cutaneous biology and wound healing.Exp Dermatol .2011;20(1):1-6.

9、Douglas HE.TGF-β in wound healing:a review .J Wound Care .2010;(9):403-406.

10、Eming SA,Smola H,Krieg T.Treatemnt of chronic wounds:state of the art and future concepts. Cella Tissues Organs .2002:172(2):105-117.

11、Lauer G,Sollberg S,Cole M, et al.Expression and proteolysis of vascular endothelial growth factor is increased in chronic wounds .J Invest Dermatol.2000;115(1):12-18.

12、Wlaschek M,Peus D,Achterberg V,et al.Protease inhibitors protect growth factor activity inchronic wounds.Br J Dermarlol .1997,;137(4):646.

13、Soscia David A,Nurazhani Abdul Raof ,Yubing Xie ,et al.Antibiotic-Loaded PLGA Nanofibers for Wound Healing Applications .Adv Engineering Materials.2010;12(4):83-88.

14、Kim IS,Lee SK,Park YM,et al .Physicochemical characterization of poly (L-lactic acid) and poly (D,L-lactide-co-glycolide)nanoparticles with polyethylenimine as gene delivery carrier.Int J Pharm.2005;298(1):225-262.

15、Cui FY,Song XR,Li ZY ,et al .The pigment epithelial-derived factor gene loaded in PLGA nanoparticles for therapy of colon carcinoma.Oncol Rep.2010;24(3):661-618.

16、Barrientos S,Stojadinovic O,Golinko MS,et al.Growth factors and cytokines in wound healing .Wound Repair Regen.2008;16(5):585-601.

17、Chen J,De S,Brainard J et al.Metastatic properties of prostate cancer cells are controlled by VEGF.Cell Commun Adhes,2004;11(1):1-11.

18、Takamiya M,Saigusa K ,Nakayashiki N,et al.Studies  on mRNA expression of basic fibeoblast growth factor in wound healing for wound age determination .Int J legal Med.2003;117（1）：46。

基金資助：上海市衛(wèi)生局科研課題（編號20114341），武警上?？傟犪t(yī)院院級科研基金項目。

作者貢獻：第一作者進行實驗設計，第一、三、四、五、六作者負責實施，第一作者負責成文、第二作者知道實驗研究并審校。

利益沖突：課題未涉及任何廠家及相關雇主或其他經濟組織直接或間接的經濟或利益的贊助。

倫理要求：研究中涉及的動物處置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相關動物倫理學標準的要求。

文章概要

以PLGA為支架聯(lián)合應用bFGF、VEGF構建納米微囊，使其作用于小鼠放射性損傷創(chuàng)面，研究利用PLGA載體轉入促進創(chuàng)傷愈合的多種生長因子在修復難治性創(chuàng)面的效果，為探索難治性創(chuàng)面的愈合機制及治療難題提供新的思路。

關鍵信息：

放射性損傷創(chuàng)面的愈合過程中不同的細胞因子發(fā)揮不同的作用，采用PLGA載體攜促進創(chuàng)傷愈合的因子，可以持續(xù)作用于創(chuàng)面，可能為臨床上治療放射性創(chuàng)傷提供新的思路和治療措置。

研究的創(chuàng)新之處和不足：

成功的建立了VEGF、bFGF聚乳酸-羥基乙酸納米微囊復合體，并使其作用于小鼠的放射性損傷創(chuàng)面，促進了此種難愈性創(chuàng)面的愈合，為臨床上治療難愈性創(chuàng)面提供了理論依據。不足之處在于目前相關的研究還處于動物實驗階段，要應用到臨床，效果如何仍有待深入研究。