王幕¹ 周志鋼¹ 董肇楊³ 唐雪鴻⁴ 曾勇³ 朱麗倩¹

武警上海市總隊(duì)醫(yī)院院級(jí)課題

【摘要】

放射性損傷創(chuàng)面作為一種難治性創(chuàng)面，其愈合過程由多種細(xì)胞因子參與調(diào)控，并發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。但目前對(duì)于難愈性創(chuàng)面愈合的研究多采用單一的細(xì)胞因子，雖可取得一定的效果，但作用時(shí)間短、作用機(jī)制單一、療效不穩(wěn)定，副作用大。羥基乙酸共聚物（PLGA）為骨架材料包裹效應(yīng)分子制成微球制劑，無毒、可降解和生物相容性好，可在有效時(shí)間點(diǎn)釋放發(fā)揮作用，是目前基因治療的新型載體，本研究利用PLGA載體轉(zhuǎn)入促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的多種生長因子，采用小鼠放射性損傷創(chuàng)面的模型，研究其在修復(fù)難治性創(chuàng)面的效果，為探索難治性創(chuàng)面的愈合機(jī)制及治療難題提供新的思路和治療措施。

背景：放射性損傷創(chuàng)面的愈合過程由多種細(xì)胞因子參與調(diào)控，并發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)，利用PLGA載體轉(zhuǎn)入促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的不同生長因子，是促進(jìn)此難愈創(chuàng)面愈合的有效措施。

目的：研究VEGF、bFGF納米微囊復(fù)合體對(duì)放射性損傷創(chuàng)面愈合的影響。方法：以PLGA為支架聯(lián)合應(yīng)用VEGF、bFGF構(gòu)建納米微囊，作用于小鼠放射性損傷創(chuàng)面作為實(shí)驗(yàn)組，未用VEGF、bFGF的做為對(duì)照組，觀察兩組創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面的病例改變；于傷后不同時(shí)間檢測(cè)創(chuàng)面新生血管細(xì)胞數(shù)目、毛細(xì)血管截?cái)嗝娣e及成纖維細(xì)胞數(shù)量；RT-PCR檢測(cè)創(chuàng)面VEGFmRNA、bFGFmRNA的表達(dá)水平；觀察其對(duì)放射性創(chuàng)面愈合的影響。結(jié)果：對(duì)于放射性損傷的小鼠創(chuàng)面，應(yīng)用bFGF、VEGF構(gòu)建納米微囊后，其創(chuàng)面愈合明顯高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組中的創(chuàng)面組織中VEGFmRNA、bFGFmRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組，兩組之間比較具有顯著性差異（P<0.05）；對(duì)創(chuàng)面組織HE染色，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組肉芽組織增多增厚，成纖維細(xì)胞數(shù)量級(jí)密度均高于對(duì)照組；傷后第8天、第15天，實(shí)驗(yàn)組的新生毛細(xì)血管數(shù)量及毛細(xì)血管橫截面積均較對(duì)照組有所增加，實(shí)驗(yàn)組的成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組，兩組之間比較均具有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論：VEGF、bFGF納米微囊復(fù)合體可以明顯促進(jìn)小鼠反射性損傷創(chuàng)面的愈合。

【關(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮生長因子；堿性成纖維因子；納米微囊；放射性損傷；創(chuàng)面愈合

1.引言

放射性物質(zhì)所導(dǎo)致的慢性創(chuàng)面損傷與普通的損傷不同，射線可穿透深部組織，引起創(chuàng)面延遲愈合，是臨床上難以處理的問題^[1]。研究表明不同的生長因子，尤其是促進(jìn)血管再生的細(xì)胞分子如血管內(nèi)發(fā)生長因子（VEGF）、堿性成纖維因子（bFGF）、血小板衍生因子（PDGF）等，在組織修復(fù)、創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要作用^[2-3]。但在發(fā)射型損傷的創(chuàng)面中，上述細(xì)胞因子表達(dá)降低。近年來研究^[4]發(fā)現(xiàn)聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）做為特殊的載體支架結(jié)合促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的細(xì)胞因子如bFGF或VEGF等可以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合?？紤]到床上愈合過程中在不同階段涉及到多種細(xì)胞因子，為此我們以PLGA為支架，聯(lián)合應(yīng)用bFGF、VEGF，觀察其對(duì)放射性損傷創(chuàng)面愈合的作用，為臨床上治療放射性損傷特供新的思路。

2.材料與方法

2.1設(shè)計(jì)：以動(dòng)物創(chuàng)面為觀察對(duì)象，進(jìn)行對(duì)比觀察

時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2013年8月至2014年10月在武警上?？傟?duì)醫(yī)院及第二軍醫(yī)大學(xué)免疫研究所共同完成

2.2材料

2.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：取48只體重（22±4）g健康雄性4-6周齡的C57BL/6小鼠由上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2.2.2方法：

VEGF/bFGF-PLGA的制備

將25mgPLGA、25mgPluronic F-127溶解在2ml二氯甲烷中職稱有機(jī)相。300ng VEGF、300ngbFGF、4ug肝素鈉和200ug人血清白蛋白加入水中制成200ul的水相。有機(jī)相與水相渦旋30秒混勻，形成油包水的乳劑。在磁力攪拌下將這個(gè)油包水的乳劑注入到25ml乙醇中。所得到的懸浮液用25ml水稀釋。將上述液體在30℃溫度下旋轉(zhuǎn)揮干，此納米粒便濃縮在水相介質(zhì)中。沒有載藥的納米粒制備時(shí)在水中未加入VEGF和bFGF，余方法同上。采用25kGyCo60照射滅菌，低溫保存。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

取48只體質(zhì)量（22±4）g健康雄性4-6周齡的C57BL/6小鼠，將小鼠按6Gy 60Co-r射線進(jìn)行一次性全身輻射建立輻射損傷動(dòng)物模型。小鼠采用全麻后，于無菌條件下在小鼠背部致1cm×1cm全層皮膚缺損傷口，創(chuàng)面不予縫合，以單純沒有載藥的PLGA覆蓋創(chuàng)面小鼠做為對(duì)照組(24只），載有VEGF和bFGF-PLGA覆蓋創(chuàng)面的小鼠做為實(shí)驗(yàn)組（24只），兩組小鼠創(chuàng)面均以TegadermTM貼膜包扎傷口，傷后小鼠自由飲食，隔日換藥，分籠飼養(yǎng)。

2.3創(chuàng)面愈合率比較

小鼠建立創(chuàng)面后當(dāng)天采用TegadermTM貼膜覆蓋創(chuàng)面，在透明膜上沿創(chuàng)面邊緣描記，然后用Image Proplusv 1.5分析圖像軟件，測(cè)量創(chuàng)面面積作為傷口原始面積。采用同樣方法在傷后第4、8、15天測(cè)量傷口殘余面積，創(chuàng)面愈合率（%）=（1-殘余面積/原始面積）×100%

標(biāo)本取材病例監(jiān)測(cè)

在兩組小鼠致傷后7天以過量麻醉藥物至死后取創(chuàng)傷創(chuàng)面組織，包括傷口周圍部分正常皮膚和創(chuàng)面下方的薄層肌肉組織，采用4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定，石蠟包埋，做成組織切片，常規(guī)H-E染色，觀察兩組病理區(qū)別。

創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)目、毛細(xì)血管截?cái)嗝娣e及成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)

在兩組小鼠（每組24只），分別在致傷后4天、8天、15天（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)八只），處死小鼠后，取創(chuàng)面組織，同上述方法做成組織切片，每張切片在高倍（400×10）顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算毛細(xì)血管截?cái)嗝娣e，分別取其平均值。

Real-timePCR檢測(cè)組織中VEGF、bFGFmRNA表達(dá)

在兩組小鼠致傷2周后，每組取八只，取局部創(chuàng)面組織，按試劑盒說明步驟提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)A260/A280值，并計(jì)算RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫，采用SYBR PT-PCR試劑盒和StepOneTM實(shí)時(shí)定量PCR定量檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試。以標(biāo)本內(nèi)GAPDH mRNA做為細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)的基準(zhǔn)，1代表對(duì)照組標(biāo)本內(nèi)目的基因表達(dá)水平，依照2-△△Ct方法進(jìn)行評(píng)估，對(duì)實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本內(nèi)測(cè)試基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化比對(duì)。所有檢測(cè)均進(jìn)行三次獨(dú)立的重復(fù)操作。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)錄入SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中如P<0.05則認(rèn)為兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）方式表示所有相關(guān)數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行組與組之間比較分析。

3結(jié)果

3.1放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA后創(chuàng)面愈合率與對(duì)照組比較

表1：兩組在創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較

*P<0.05

如表1顯示，放射性損傷創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA后，在傷后不同時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后第4天，第8天，第15天）未應(yīng)用VEGF、bFGF的對(duì)照組比較，在傷后第4天，治療組的創(chuàng)面愈合率要大于對(duì)照組，但兩者之間比較未見顯著性差異。治療組在傷后第8天及第15天，創(chuàng)面愈合率要高于對(duì)照組，兩組之間比較具有顯著性意義（P<0.05）。

3.2

放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA15天后創(chuàng)面（實(shí)驗(yàn)組）與對(duì)照組比較，選取放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA與未用VEGF/bFGF-PLGA的對(duì)照組小鼠，在創(chuàng)傷后15天分別取創(chuàng)面組織，觀察創(chuàng)面組織中VEGF、bFGFmRNA的表達(dá)，結(jié)果（如圖1顯示）發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中的創(chuàng)面組織中VEGFmRNA、bFGFmRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組，兩組之間比較具有顯著性差異（P<0.05）。

圖1：放射性損傷創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA15天后與對(duì)照組兩組間VEGFmRNA、bFGFmRNA表達(dá)的比較

3.3病理組織學(xué)結(jié)果

在致小鼠放射性創(chuàng)傷后7天，以小鼠創(chuàng)面給予未截細(xì)胞因子的納米顆粒處理的做為對(duì)照組，VEGF/bFGF-PLGA納米顆粒覆蓋創(chuàng)傷面的小鼠做為實(shí)驗(yàn)組，取創(chuàng)面組織做常規(guī)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)：如對(duì)照組圖中所示，創(chuàng)面肉芽組織層偏薄，新生的毛細(xì)血管較少，成纖維細(xì)胞少；采用VEGF/bFGF-PLGA的實(shí)驗(yàn)組中，肉芽組織增多增厚，成纖維細(xì)胞數(shù)量及密度均高于對(duì)照組。

3.4

放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA后創(chuàng)面（實(shí)驗(yàn)組）與對(duì)照組的創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)目及毛細(xì)血管橫截面積比較

如圖2顯示，在傷后第4天，應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA的實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面新生毛細(xì)血管計(jì)數(shù)及毛細(xì)血管橫截面積均高于對(duì)照組，但兩組之間未見顯著性差異（P>0.05），在傷后第8天、第15天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的新生毛細(xì)血管數(shù)量及毛細(xì)血管橫截面積均較對(duì)照組有所增加，兩組之間比較均具有顯著性差異（P<0.05）。

圖2：放射性損傷創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩組間毛細(xì)血管計(jì)數(shù)及毛細(xì)血管橫截面積的比較

3.5

放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA后創(chuàng)面（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的創(chuàng)面成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

如圖3顯示，在傷后第4天，應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA的實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面的成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)要略高于對(duì)照組，但兩組之間未見顯著性差異（P>0.05），而傷后第8天、第15天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組，兩組之間比較均具有顯著性差異（P<0.05）。

圖3：傷后不同時(shí)間點(diǎn)，放射性損傷創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

4.討論

臨床放射性治療、核輻射等所導(dǎo)致的組織損傷，局部組織損傷嚴(yán)重，細(xì)胞生存環(huán)境變化大，尤其是當(dāng)這一類病人在合并全層皮膚組織創(chuàng)傷及深層組織損傷時(shí)，其傷口的愈合及其困難，甚至形成難愈性創(chuàng)面，給患者的生活和經(jīng)濟(jì)帶來很大的負(fù)擔(dān)。研究表明放射性損傷愈合困難的主要原因在于創(chuàng)傷早期炎性反應(yīng)削弱、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖減少；后期肉芽組織及膠原基質(zhì)產(chǎn)生減少，使上皮化減慢。^[5]

近年來的研究表明在促進(jìn)放射性損傷創(chuàng)面愈合方面，不同生長因子在創(chuàng)傷愈合的不同階段發(fā)揮著重要的作用^[6-7]。創(chuàng)傷的組織修復(fù)及愈合過程中包含著諸多如細(xì)胞的分裂及遷移、合成新的基質(zhì)、新生的血管形成、新生的上皮細(xì)胞等細(xì)胞參與的活動(dòng)^[8-9]。但細(xì)胞生長因子在創(chuàng)面促愈的過程中均存在著半衰期短的問題，需要特定的保護(hù)劑和良好的投遞系統(tǒng)的存在才能發(fā)揮作用，同時(shí)創(chuàng)面中所包含的間充質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞也通過其釋放到創(chuàng)面組織中的酶，降解發(fā)揮促進(jìn)愈合的細(xì)胞因子，使其發(fā)揮的作用大大學(xué)削弱^[10-12]?；谏鲜鲈?，因此需要特殊的載體物質(zhì)使發(fā)揮作用的生長因子持續(xù)作用于創(chuàng)口，才能更有力于創(chuàng)面修復(fù)。近年來的一些研究結(jié)果^[15-17]表明，利用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球做為新型的載體混合生長因子制成復(fù)合緩釋劑，不僅具有無毒、可生物降解和生物相容性好等特征，而且其降解的時(shí)間可受分子量和聚合物含量比例的調(diào)節(jié)，很大程度上保持了生長因子的活性和持續(xù)釋放，真正達(dá)到了加速創(chuàng)面的愈合、提高其愈合質(zhì)量的目的。

慢性放誰像你個(gè)損傷創(chuàng)面的修復(fù)比較復(fù)雜，肉芽組織增生是其中重要一環(huán)，其主要由新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞組成。研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)血管生成及成纖維細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，可以加速創(chuàng)面愈合。^[16]血管內(nèi)皮生長因子（VGEF)特異性地與血管內(nèi)皮細(xì)胞作用，并可使序貫的通透性增加，血漿蛋白滲出到血管周圍的間隙中，滲漏到血管周圍的纖維蛋白原會(huì)轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，促進(jìn)血管形成并不斷擴(kuò)大生長。^[17]堿性成纖維因子（bFGF）是一組多肽，其生物學(xué)活性比較廣泛，其可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其有絲分裂，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌某些蛋白酶，溶解并侵入周圍基質(zhì)，進(jìn)而形成毛細(xì)血管；同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞向創(chuàng)面遷移，加速創(chuàng)面的愈合。^[18]

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建小鼠的放射性損傷模型，以PLGA為支架，聯(lián)合應(yīng)用bFGF、VGEF，觀察VEGF/bFGF-PLGA在放射性損傷創(chuàng)面愈合中的作用及可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)在放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA15天后，創(chuàng)面組織中VGEF、bFGFmRNA的表達(dá)明顯升高，同時(shí)治療組在傷后第8天及第15天，創(chuàng)面愈合率要高于對(duì)照組，兩組之間比較具有顯著性意義（P<0.05），提示在放射性損傷創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA后，創(chuàng)面可以持續(xù)地高表達(dá)bFGF和VGEF，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

通過本實(shí)驗(yàn)對(duì)放射性損傷小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA后的病理分析發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用VEGF/bFGF-PLGA第8天及第15天后，實(shí)驗(yàn)組的新生毛細(xì)血管數(shù)量及毛細(xì)血管橫截面積均較對(duì)照組有所增加，兩組之間比較均具有顯著性差異（P<0.05）；同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)也明顯高于對(duì)照組，兩組之間比較（P<0.05），均具有顯著性差異。上述研究進(jìn)一步說明VEGF/bFGF-PLGA促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的機(jī)制可能在于其使放射性損傷創(chuàng)面的肉芽組織中bFGF、VEGF的mRNA表達(dá)升高，使bFGF、VEGF發(fā)揮共同的作用，促進(jìn)了創(chuàng)面新生血管的生成及成纖維細(xì)胞的增殖，改善了創(chuàng)面的血液循環(huán)，從而使創(chuàng)面愈合速度加快，促使放射性損傷創(chuàng)面愈合。本實(shí)驗(yàn)的研究為豐富難愈傷口的理論提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為治療放射性損傷創(chuàng)面提供了新的思路。

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基金資助：上海市衛(wèi)生局科研課題（編號(hào)20114341），武警上?？傟?duì)醫(yī)院院級(jí)科研基金項(xiàng)目。

作者貢獻(xiàn)：第一作者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，第一、三、四、五、六作者負(fù)責(zé)實(shí)施，第一作者負(fù)責(zé)成文、第二作者知道實(shí)驗(yàn)研究并審校。

利益沖突：課題未涉及任何廠家及相關(guān)雇主或其他經(jīng)濟(jì)組織直接或間接的經(jīng)濟(jì)或利益的贊助。

倫理要求：研究中涉及的動(dòng)物處置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

文章概要

以PLGA為支架聯(lián)合應(yīng)用bFGF、VEGF構(gòu)建納米微囊，使其作用于小鼠放射性損傷創(chuàng)面，研究利用PLGA載體轉(zhuǎn)入促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的多種生長因子在修復(fù)難治性創(chuàng)面的效果，為探索難治性創(chuàng)面的愈合機(jī)制及治療難題提供新的思路。

關(guān)鍵信息：

放射性損傷創(chuàng)面的愈合過程中不同的細(xì)胞因子發(fā)揮不同的作用，采用PLGA載體攜促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的因子，可以持續(xù)作用于創(chuàng)面，可能為臨床上治療放射性創(chuàng)傷提供新的思路和治療措置。

研究的創(chuàng)新之處和不足：

成功的建立了VEGF、bFGF聚乳酸-羥基乙酸納米微囊復(fù)合體，并使其作用于小鼠的放射性損傷創(chuàng)面，促進(jìn)了此種難愈性創(chuàng)面的愈合，為臨床上治療難愈性創(chuàng)面提供了理論依據(jù)。不足之處在于目前相關(guān)的研究還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，要應(yīng)用到臨床，效果如何仍有待深入研究。