石家莊白求恩國際和平醫(yī)院燒傷整形科  楊建民 王鵬 史少蕊

干細(xì)胞中心  王更銀 李俊峽

石家莊市第一醫(yī)院整形美容中心 劉坤坤 劉超 賈玉磊

【摘要】

目的：研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCNSC）和人汗腺細(xì)胞（SGC）合核細(xì)胞的生物學(xué)特性，為汗腺再生探索新的方法和途徑。方法：（1）體外分離培養(yǎng)UCNSC和SGC，通過檢測CD14、CD44、CD29、CD105、CD34、CD45表達(dá)情況鑒定UCNSC，檢測CK19、CEA表達(dá)情況鑒定SGC。（2）制取、檢測間充質(zhì)干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞合核細(xì)胞，用PKH26、CFSE分別對UCNSC、SGC進(jìn)行標(biāo)記，用聚乙二醇（PFG）化學(xué)融合法制備間充質(zhì)干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合體，通過熒光顯微鏡熒光觀察篩選融合細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)：1周后流式細(xì)胞儀檢測合核細(xì)胞中CD14、CD44、CD29、CD34、CD45表達(dá)率，免疫組織化學(xué)檢測CK19、CEA表達(dá)情況。結(jié)果：間充質(zhì)干細(xì)胞/汗腺細(xì)合核細(xì)胞的免疫組化檢測CEA和CK19表面抗原均為陽性，流式細(xì)胞術(shù)檢測表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)率較高。結(jié)論：誘導(dǎo)融合后的間充質(zhì)干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞合核細(xì)胞同時(shí)具備干細(xì)胞合汗腺細(xì)胞的表型。

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；汗腺干細(xì)胞；融合細(xì)胞；再生；聚乙二醇化學(xué)融合法

大面積嚴(yán)重?zé)齻箘?chuàng)面皮膚附屬器官被破壞，喪失了正常分泌汗液、調(diào)節(jié)體溫的功能，使患者的生活質(zhì)量降低。如何解決汗腺的再生問題已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。本研究利用細(xì)胞融合技術(shù)使人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞融合產(chǎn)生合核細(xì)胞，理論上合核細(xì)胞保留了干細(xì)胞的可擴(kuò)增特性和汗腺細(xì)胞的分泌汗液特性，為燒傷后汗腺再生提供新方法和途徑。

1.材料與方法

1.1標(biāo)本來源

臍帶組織來自本院婦產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)的健康胎兒臍帶，全層皮膚來自于本院燒傷整形科頭部皮膚擴(kuò)張器Ⅱ期術(shù)后的多余正常皮膚。所有標(biāo)本均在無菌條件下收集處理，使用時(shí)均獲得產(chǎn)婦及家屬知情同意，并簽署同意書。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基購自Hyclone公司，10%胎牛血清（PBS）購自Gibco公司、重組表皮細(xì)胞生長因子（EGF）購自Pepro Tech公司，三碘甲狀腺原氨酸（T3）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉（ITS）、PKH26細(xì)胞染色試劑盒購自美國Sigma公司，琥珀酰氫化考的松購自Calbipchem公司，胰蛋白酶/EDTA消化液自Solarbio公司，GEP細(xì)胞融合實(shí)際盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，CFDA SE細(xì)胞增殖與失蹤檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得及其標(biāo)記

用組織塊培養(yǎng)法獲得UCMSC，將二代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，離心、取沉淀，用稀釋液C重懸細(xì)胞后，放入PKH26工作液中染色1-5min，血清終止反應(yīng)，DMEM/F12完全培養(yǎng)基洗滌2次后正常培養(yǎng)（具體操作步驟按說明書進(jìn)行）。熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記效果。倒置相差顯微鏡下觀察標(biāo)記后細(xì)胞形態(tài)。

1.4人汗腺細(xì)胞的獲得及標(biāo)記

用膠原酶消化法獲得SGC，將一代汗腺細(xì)胞消制單細(xì)胞懸液，離心、取沉淀，加入CFDA細(xì)胞標(biāo)記液和CFDA SE儲(chǔ)存液（2X）進(jìn)行標(biāo)記，完全培養(yǎng)液（含血清）終止標(biāo)記，洗滌三次后正常培養(yǎng)（具體操作按說明書進(jìn)行）。在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記效果。

1.5 間充質(zhì)干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合及篩選

融合方法：分別取對數(shù)生長期已標(biāo)記的P3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和已標(biāo)記的P0代汗腺細(xì)胞，傳代24小時(shí)候用5mlGENMED清理液（reagentA）清洗，分別加入4×10⁶的兩個(gè)父代細(xì)胞到一個(gè)50ml錐形離心管，300×g離心10min，去上清后用10ml GENMED清理液（reagentA）洗滌一次，取細(xì)胞沉淀加入105ml GENMED融合液（reagent B）混勻，置室溫下1min，用10ml GENMED清理液（reagentA）洗滌一次，去上清后正常培養(yǎng)（具體操作步驟按說明書進(jìn)行）。在倒置相差顯微鏡下觀察融合后細(xì)胞形態(tài)。

篩選方法：換液后調(diào)整細(xì)胞為1~5個(gè)細(xì)胞/ml；取96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液200μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中；待細(xì)胞貼壁后，在熒光顯微鏡下標(biāo)記出同時(shí)顯影紅色熒光和綠色熒光的孔，將標(biāo)記孔內(nèi)的細(xì)胞收集后培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況檢測并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5觀察指標(biāo)

間充質(zhì)干細(xì)胞和人汗腺細(xì)胞，分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀、免疫組織化學(xué)檢測；培養(yǎng)1周后的合核細(xì)胞同時(shí)行流式細(xì)胞儀和免疫組織化學(xué)檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)a=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 UC-MSCs分離、培養(yǎng)基鑒定

培養(yǎng)1周后可見較多UCMSC呈梭形成纖維樣細(xì)胞生長；2周后達(dá)80%融合，傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)良好，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對分離培養(yǎng)的UC-MSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)率較高，分別為99.9%、99.8%、95.7%；造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達(dá)，分別為0.0%、0.2%、0.2%。提示本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)的細(xì)胞是交純化的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以用于實(shí)驗(yàn)研究，PKH26標(biāo)記后的間充質(zhì)干細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀，細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，染色較均勻，細(xì)胞貼壁好（圖1）

圖1 PKH26標(biāo)記后的間充質(zhì)干細(xì)胞

現(xiàn)紅色熒光 熒光顯微鏡×300

2.2 汗腺細(xì)胞（h-SGCs）的培養(yǎng)

培養(yǎng)7天后，已有汗腺貼壁，鏡下可見少量汗腺團(tuán)塊周圍爬出不規(guī)則形細(xì)胞，呈集落狀生長；10天后，鏡下可見汗腺團(tuán)塊周圍爬滿不規(guī)則細(xì)胞，呈鋪路石樣生長，CEA和CK19表面抗原檢測為陽性（圖2），CFDA SE標(biāo)記后的汗腺細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀，呈現(xiàn)為綠色熒光，染色較均勻（圖3）。

圖2 培養(yǎng)10天后的汗腺細(xì)胞成鋪路

石樣 倒置相差顯微鏡×40

圖3 FDA SE 標(biāo)記的汗腺細(xì)胞呈現(xiàn)

為綠色熒光  熒光顯微鏡×300

2.3

干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合細(xì)胞的篩選、鑒定；在熒光顯微鏡下融合細(xì)胞同時(shí)顯示紅色熒光和綠色熒光，紅色熒光主要分布在細(xì)胞膜，綠色熒光主要在細(xì)胞質(zhì)尤其是細(xì)胞核附近。融合細(xì)胞高表達(dá)部分干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)率分別為69.1%、64.1%、99.0%（圖4），融合細(xì)胞CEA和CK19表面抗原檢測為陽性（圖5）

 圖4 融合細(xì)胞高表達(dá)部分干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105，表達(dá)率分別為69.1%、64.1%、99.0%

圖5  免疫組織化學(xué)檢測融合細(xì)胞CEA合CK19表面抗原為陽性

2.4

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；融合細(xì)胞CEA合CK19陽性率分別為78%和85%，對照組CEA和CK19的陽性率分別為7.5%和3.5%（P<0.05）有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表1）。同時(shí)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此次試驗(yàn)分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)融合的干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合體同時(shí)具有部分干細(xì)胞的生物學(xué)特性和汗腺細(xì)胞的生物學(xué)特性。

表1 對照組和實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色CEA和CK19表達(dá)情況比較（% `x±s)

與對照組比較：*P<0.05

討論

大面積深度燒傷幸存者因汗腺損毀或瘢痕增生，使皮膚喪失了正常分泌汗液、調(diào)節(jié)體溫的功能，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。無論是應(yīng)用自體皮片或普通組織工程皮移植創(chuàng)面均無法使汗腺再生，因此如何實(shí)現(xiàn)大面積深度燒傷創(chuàng)面汗腺的重建，成為目前亟待解決的難題。

隨著再生醫(yī)學(xué)深入發(fā)展，為解決以上難題提供了新的思路。細(xì)胞融合最早是Barski等于1961年首次發(fā)現(xiàn)，此后相繼研究處3類成熟的細(xì)胞融合技術(shù)：①生物法：滅火病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合。②化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)細(xì)胞融合③物理法：電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合和激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合[2-4]、從理論上可以說利用細(xì)胞融合技術(shù)可以使任何兩個(gè)細(xì)胞通過體細(xì)胞雜交融合而形成新的生物資源，它是繼基因工程技術(shù)出現(xiàn)并發(fā)展以來一種更為有效轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的手段[5]。本次試驗(yàn)中將間充質(zhì)干細(xì)胞與汗腺細(xì)胞雜交融合形成了新的資源，我們得到了一種既能快速擴(kuò)增，又能分泌汗腺的細(xì)胞。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞UC-MSCs作為試驗(yàn)中父代細(xì)胞之一是因?yàn)槠渚哂衼碓闯渥悖@取時(shí)無創(chuàng)。原代培養(yǎng)容易，純度高等特點(diǎn)[6-8]，更重要的是UC-MSCs抗原性低，免疫系統(tǒng)排斥小，同原始細(xì)胞更加接近，可作為臨床上各種異體間移植的重要干細(xì)胞來源[9-10]。這利于將融合細(xì)胞用于同種異體尖移植為以后臨床實(shí)驗(yàn)打基礎(chǔ)。本次實(shí)驗(yàn)用于干細(xì)胞取代腫瘤細(xì)胞，作為父代細(xì)胞，這使得容二虎細(xì)胞移植到人體成為可能，也為其他融合實(shí)驗(yàn)提供了一種新的思路，而且與有免疫缺陷的重力細(xì)胞株相比，MSCs來源豐富、分離培養(yǎng)相對簡單[11-13]。

汗腺細(xì)胞的特異性抗原標(biāo)志物還沒有發(fā)現(xiàn)。但研究發(fā)現(xiàn)CEA，在胎兒和成人皮膚的汗腺導(dǎo)管部、分泌部均有表達(dá)，在胎兒的小汗腺中也有表達(dá)，在表皮的其他部位不表達(dá)。CK19是上皮細(xì)胞的特異性抗原標(biāo)志物，在汗腺細(xì)胞中也有表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)用CEA與CK19作為汗腺細(xì)胞的表面標(biāo)志物進(jìn)行免疫組織組化檢測。

間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺融合的現(xiàn)象在國外早有報(bào)道，2005年我國學(xué)者在國內(nèi)首次報(bào)道了間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞融體，并做了相關(guān)檢驗(yàn)證明融合體同時(shí)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞兩個(gè)親本的標(biāo)志性細(xì)胞表面標(biāo)記物[14]。在這之間和以后的時(shí)間里，許多學(xué)者又對融合體做了相關(guān)研究和報(bào)道，這為本次實(shí)驗(yàn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。之前多名學(xué)者發(fā)現(xiàn)已分化的體細(xì)胞能夠通過重編程轉(zhuǎn)化回多能干細(xì)胞，而且通過干細(xì)胞和體細(xì)胞的細(xì)胞融合，可使體細(xì)胞重編程[15]，這在細(xì)胞移植領(lǐng)域具有重要意義。細(xì)胞融合致體細(xì)胞重編程速度快、效率高，是一種研究重編程機(jī)制的重要手段。本次試驗(yàn)將多能MSCs與成體SGCs融合，對其融合體進(jìn)行檢測看是否保留多能MSCs與成體SGCs兩者的特征，為進(jìn)一步用融合細(xì)胞進(jìn)過誘導(dǎo)培養(yǎng)分化成汗腺器官做初步研究。

我們將有限稀釋法和雙熒光標(biāo)記相結(jié)合，成功挑選出干細(xì)胞與汗腺細(xì)胞融合體，這種方法使得干細(xì)胞代替有免疫缺陷的腫瘤細(xì)胞作為父代細(xì)胞應(yīng)用于融合實(shí)驗(yàn)。其中雙熒光標(biāo)記本次實(shí)驗(yàn)采用的是PKH26和CFDA-SE。PKH26作為一種紅色熒光染料，可以與細(xì)胞膜不可逆地結(jié)合，從而對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，是一種簡便的標(biāo)記細(xì)胞的方法[16-17]。CFSE（二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯）作為一種綠色熒光，是一種細(xì)胞膜穿透性熒光染料，不可逆地與細(xì)胞內(nèi)蛋白的Lysine殘基或其他氨基結(jié)合，且不會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生凋亡或死亡[18]。這兩種染料對細(xì)胞的毒害作用小，減少了干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞融合的不確定因素。

本次試驗(yàn)中干細(xì)胞與汗腺細(xì)胞融合形成的細(xì)胞株，成功解決了再造汗腺組織工程中種子細(xì)胞嚴(yán)重缺乏這一瓶頸問題。以往實(shí)驗(yàn)中干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化率太低，汗腺細(xì)胞不能大量獲取，阻礙了汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化為汗腺組織的實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，通過本次實(shí)驗(yàn)使得研究人員可以隨時(shí)通過復(fù)蘇細(xì)胞株來得到大量能分泌汗液的汗腺樣細(xì)胞，以便接下來得實(shí)驗(yàn)研究。本次實(shí)驗(yàn)方法雖然復(fù)雜繁瑣。但其結(jié)果融合細(xì)胞的成功篩選、鑒定已經(jīng)證明了融合技術(shù)在汗腺再生這一研究領(lǐng)域的可行性，為大面積重度燒傷汗腺器官重建指明了一個(gè)新的研究方向，因研究條件及研究時(shí)間的限制，本次實(shí)驗(yàn)并未對干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞的雜合細(xì)胞做進(jìn)一步檢測，融合細(xì)胞是否具有致瘤性仍需進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來論證。

參考文獻(xiàn)

1 Schon M,Benwood J,O Connell2Willstaedt T,et al .Human sweat gland myoepithelial cells express a unigue set of cytokeratins  and reveal the potential for alternative epithelial and mesenchymal differentiation states in culture[J].J Cell Sci ,1999,112(12):1925-1936

2 鄭國錩，王新宇，聶秀菀等 細(xì)胞融合（Cytomixis）研究的進(jìn)展與展望。中國科學(xué)基金，2000,06（01）：19-22

3 霍乃蕊，孟利梅 細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展。動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，Progress In Veterinary Medicine,2005,26（03）：32-35

4 李保華 細(xì)胞融合技術(shù)研究進(jìn)展 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,36（15）：6187-6188

5 趙志強(qiáng) 鄭小琳 張思杰等 細(xì)胞融合技術(shù) 生物學(xué)通報(bào)，2005,40（10）40-41

6 Karahuseyinoglu S,Cinar O,Kili E,et al.Biology of the stem cells in human umbilical cord stroma;In situ and in vitro surveys .Stem Cells ,2007,25(02):319-331

7 Mariane Secco ,Eder Zucooni ,Natassia M,Vieera ,et al.Multipotent Stem Cells from Umbilical Cord:Cord Is Richer than Blood STEM CELLS,Stem Cells,2008,26(01)146-150

8 Conget PA,Minguell JJ,Phenotypital and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells[J].Cell Physiol ,1999,18(01):67-73

9 季風(fēng)清，王屹，孫海梅等 人臍血非造血干細(xì)胞免疫原型的實(shí)驗(yàn)研究。解剖學(xué)報(bào)，208,39（1）：55-59

10 Cecilia Gotherstro,Olle Ringde ,Charlotte Tammik ,et al.Immunologic properties of human fetal mesenchymal stem cells .American Journal of Obstetrics and Gynecology,2004,190(01):239-245

11 郝白露，楊瑞峰，彭祥熾等 改良的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。中國計(jì)劃生育學(xué)雜志，2013,21（01）：44-49

12 孫建華，丁鐫 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性與研究進(jìn)展，臨床輸血與檢驗(yàn),2013,15（02）：90-195

13 孫麗，于麗，張華芳等 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性。解剖科學(xué)進(jìn)展，2011,17（02）：131-134

14 李海紅，付小兵，周崗等 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與汗腺細(xì)胞共同培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的初步研究，中華醫(yī)學(xué)雜志，2005,85（27）：1885-1889

15 吳畏，徐海偉，屈婭等 細(xì)胞融合致體細(xì)胞重編程機(jī)制研究進(jìn)展。生命科，2012,24（04）：380-384

16 Haas J,Bauer P,Rolfs A,et al.Immunocytochemical characterization of in vitro PKH2621labelled and intracerebrally transplanted neonatal cells[J].Acta2Histochem,2000,102(3):273-280

17 Boutonnat J,Muirhead KA,Barbier M,et al.PKH26 probe in the study of the proliferation of chemoresistant leukemic sublines[J].Anticancer Res ,1998,18(6A):4243-4251

18 Dumitriu IE,MohrW,KoloeosW,et al.5,62carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester21abeled cell samples [J],AnalBiochem ,2001,299(2):247-252