安徽中醫(yī)藥大學護理學院美容醫(yī)學教研室  葉伊琳 唐潔

安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)臨床學院藥理學教研室 李莉

【摘要】

目的：觀察復方補骨脂搽劑對白癜風豚鼠模型外周血中CD4⁺/CD8⁺比值以及對化學脫色皮損區(qū)TNF-a、IL-6表達的影響，探討復方補骨脂搽劑對促進實驗動物黑色素形成的作用。方法：選取健康豚鼠60只隨機分為正常組、模型組、復方補骨脂搽劑高、中、低劑量和陽性藥組（復方卡力孜然）共6組，除正常組外用化學脫色法建立白癜風皮損模型，對相應組別采用不同劑量的復方補骨脂搽劑或陽性藥治療。免疫組化檢測各組皮損區(qū)TNF-a及IL-6表達水平，流式細胞儀檢測動物外周血中CD4⁺和CD8⁺水平，計算CD4⁺/CD8⁺比值水平并進行分析比較。結果：模型組CD4⁺/CD8⁺比值顯著低于正常對照組，TNF-a和IL-6表達明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；復方補骨脂搽劑高、中劑量組和陽性藥組TNF-a及IL-6表達與模型組相比明顯下降，CD4⁺/CD8⁺比值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：實驗動物皮損區(qū)TNF-a及IL-6表達水平的上升可能參與了白癜風的發(fā)病，而復方補骨脂搽劑可明顯降低TNF-a及IL-6的表達，并改善實驗動物細胞免疫狀況，進而對白癜風實現(xiàn)一定的治療作用。

【關鍵詞】復方補骨脂搽劑；白癜風；豚鼠模型；細胞免疫；TNF-a；IL-6

   白癜風是皮膚科常見的一種局限或泛發(fā)的色素脫失性皮膚病，其發(fā)病機制尚未得到完全闡明。幾年來眾多研究證實[1]，白癜風的發(fā)病與自身免疫機制有關。白癜風的細胞免疫學證據(jù)主要表現(xiàn)在CD4⁺/CD8⁺比值降低。同時人體的免疫效應多通過細胞因子介導，因此腫瘤壞死因子（TNF-a）、白細胞介素-6（IL-6）等在白癜風發(fā)生、發(fā)展中的作用日益得到研究人員的關注。

1.材料與方法

1.1實驗動物

取普通級健康黑色或黑花豚鼠60只（黑色皮膚，雌雄各30只），體重300~350g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，動物合格證號：2011A032.

1.2主要藥品、試劑及儀器

復方補骨脂搽劑（取補骨脂30g、菟絲子20g、梔子20g，將藥材用95%乙醇200ml浸泡，15天后，過濾，留取浸出液，含量：0.5g生藥/ml）。復方卡力孜然酊原液（新疆維阿唐制藥有限公司生產(chǎn)，批號20100802），對苯二酚（氫醌，廣東汕頭市西隴化工廠生產(chǎn)，批號07072928）。754-紫外可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn)），TB-718生物組織自動包埋機（湖北孝感市泰維電子有限公司生產(chǎn)），PAS流式細胞儀（德國Partec公司生產(chǎn)）。

1.3實驗模型制備

將實驗豚鼠隨機分為6組：正常組、模型組、復方補骨脂搽劑高、中、低劑量組和陽性藥組（復方卡力孜然），剪去背部黑色皮膚區(qū)毛約4×4cm²，用8%的硫化鈉脫毛，每4天1次。除正常組，其余各組在脫毛區(qū)涂5%氫醌1ml bid[1、2]，連續(xù)50d，以制備白癜風動物模型。正常組在脫毛區(qū)涂蒸餾水1ml bid。造模第11天，各組分別每天在涂抹氫醌后1小時涂藥，其中正常組、模型組涂溶媒（95%酒精）1ml，復方補骨脂搽劑高、中、低劑量分別涂復方補骨脂搽劑（1g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml）3次/天，1ml/次，陽性藥組涂復方卡力孜然酊（新疆維阿堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號20100802）1ml，3次/天，各組涂藥后，日光照射15min，連續(xù)給藥40d。在此期間，各組豚鼠每3d剃毛1次。

1.4試驗方法

處死豚鼠，取皮損中心約1×1cm面積皮膚標本，給予10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm厚）。HE染色，觀察標本組織學的變化。用硫酸亞鐵lillie法進行黑色染色。切片脫蠟水化，微波爐中檔10min預處理、PBS沖洗；3%H₂O₂室溫孵育10min，PBS沖洗后，一次滴加一抗鼠抗人單克隆抗體，37℃60min、PBS沖洗3次×5min，滴入生物素標記的二抗羊抗兔IgG37℃ 10 min、SABC工作液37℃ 30min，每步反應后均以PBS沖洗3min×3次，新鮮配制的DAB溶液顯色10min，蘇木素復染3~5min，蒸餾水沖洗，脫水、透明后以中性樹膠封片進行鏡檢。用已知的陽性切片坐陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。CD4⁺/CD8⁺檢測采用流式細胞儀，抽取各組實驗動物外周血0.5ml。分析5000個淋巴細胞，操作嚴格按照試劑操作說明進行。

1.4 結果判定

TNF-a和IL-6標記陽性的切片為表皮細胞漿或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機選取5個高倍（40倍物鏡）視野觀察并采圖，測量光密度值。測定視野中表皮基底層中陽性細胞平均灰度。

1.5統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（`x±s）表示，采用SPSS11.0 for windows軟件處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，計量資料采用單因素方差分析。P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2.結果

實驗過程中，模型組和中劑量組各有1只豚鼠死亡，陽性藥組和高劑量組各有2只豚鼠死亡，均予退出實驗。

TNF-a和IL-6陽性細胞主要分布于表皮基底層、棘層、顆粒層，正常對照組均呈弱陽性表達。模型組TNF-a和IL-6表達明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；復方補骨脂搽劑高劑量組、中劑量組和陽性藥組TNF-a和IL-6表達與模型組相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但低劑量組TNF-a和IL-6表達與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（P?0.05）。

模型組CD4⁺含量及CD4⁺/CD8⁺比值均顯著低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；復方補骨脂搽劑高、中劑量組和陽性藥組CD4⁺含量及CD4⁺/CD8⁺比值與模型組相比顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但低劑量組CD4⁺含量及CD4⁺/CD8⁺比值與模型組相比無統(tǒng)計學意義（P?0.05），各組CD8⁺含量均無統(tǒng)計學差異（P?0.05）。詳見表1和圖1、2.

表1：各組TNF-a、IL-6表達水平及CD4⁺、CD8⁺含量與比值比較

注：與正常組比較：*P<0.01，與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

圖1：復方補骨脂搽劑對實驗性白癜風模型皮膚IL-6表達的影響

圖2：復方補骨脂搽劑對實驗性白癜風模型皮膚TNF-a表達的影響

3.討論

白癜風的發(fā)病機制至今尚未得到完全闡明。在對其病因的探索中，自身免疫機制與本病的聯(lián)系近年來得到研究人員越來越多的關注。近年來，伴隨黑素細胞免疫學功能研究新成果的顯現(xiàn)，學者們開始觀察白癜風的細胞免疫學改變，即由T淋巴細胞執(zhí)行特異性免疫功能所引發(fā)的黑素細胞受損。有研究表明[2]：白癜風患者外周血淋巴細胞計數(shù)和分類存在異常，CD4⁺/CD8⁺比值下降。活動性白癜風患者尤其是非節(jié)段型患者的外周血中CD4⁺細胞顯著減少，尤其是泛發(fā)型患者同時還伴有CD8⁺細胞數(shù)量的增加。對此有學者認為外周CD4⁺細胞數(shù)量下降局部細胞發(fā)生CD4⁺細胞遷移和局部集中的結果。本次研究顯示，模型組CD4⁺/CD8⁺比值顯著低于正常對照組，也印證了既往研究的結果。

白癜風的發(fā)生和發(fā)展與自身免疫系統(tǒng)各個方面、各個環(huán)節(jié)存在密切的聯(lián)系。甚至其他致病因素，如氧化應激機制，遺傳機制，也可能有免疫因素的參與。而機體的免疫應答大部分經(jīng)由細胞因子調(diào)控，所以細胞因子與白癜風的發(fā)病關系就顯得尤為重要。

既往研究顯示[3]，白癜風患者皮損區(qū)域促使黑色素細胞凋亡和破壞的細胞因子TNF-a與IL-6水平大幅升高，顯示二者可能在白癜風的發(fā)病中起到了一定的促進作用。

TNF-a是由單核-巨噬細胞、T細胞、自然殺傷細胞合成并分泌的一種細胞因子，具有調(diào)節(jié)機體免疫反應等生物效應。TNF-a一方面是人體的不可或缺的防御介質(zhì)，另一方面也可能導致機體的免疫性損傷，引發(fā)一系列自身免疫性疾病。TNF-a還是一種誘導細胞凋亡的相關因子。研究人員應用免疫組化、原位雜交技術對白癜風患者外周血T細胞TNF-a的表達進行了研究，結果顯示白癜風患者外周血T細胞TNF-a表達水平顯著增加，提示TNF-a可能在白癜風發(fā)病機制中起一定作用；且黑素細胞膜表面存在TNF-a受體，由此進一步推測TNF-TNR途徑可能參與了黑素細胞的凋亡[4]。

有研究顯示[5]，TNF-a可使黑素細胞出現(xiàn)顯著的形態(tài)學改變，使細胞呈現(xiàn)梭形、兩極化變化。同時用不同濃度的TNF-a與黑素細胞共同培養(yǎng)，結果顯示不同濃度的TNF-a均對黑素細胞的增殖產(chǎn)生了一定的抑制效應。且濃度越高抑制作用越顯著，即表現(xiàn)為濃度依賴性。

IL-6是一種可產(chǎn)生多種生物學效應的刺激因子，在某些疾病的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用。有研究顯示[6]，白癜風患者在治療前血清IL-6水平顯著高于對照組，治療3個月后與對照組比較仍有顯著性差異。白癜風患者IL-6升高的機制可能是其體內(nèi)的細胞網(wǎng)絡遭到破壞，使可持續(xù)分泌IL-6及與IL-6受體結合的刺激細胞增殖，進而導致皮膚局部損害。

綜上所述，白癜風病因較為復雜，國內(nèi)外眾多研究都支持本病是一種自身免疫性疾患，皮損區(qū)和外周血中細胞因子的水平改變引發(fā)了免疫反應和炎癥反應的發(fā)生和進展。從細胞因子層面深入研究白癜風的發(fā)病機理，探尋特異性地可觀指標，無疑有助于判斷該病的活動性及嚴重度，為提高其臨床診療水平帶來新的希望[7]。

本次研究顯示，復方補骨脂搽劑高、中劑量組和陽性藥組TNF-a及IL-6表達與模型組相比明顯下降，復方補骨脂搽劑高、中劑量組和陽性藥組CD4⁺/CD8⁺比值與模型組相比顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義。說明復方補骨脂搽劑可明顯降低TNF-a及IL-6的表達，改善患者細胞免疫的異常狀態(tài)，進而對白癜風實現(xiàn)一定的治療作用。改療法值得在臨床上進一步研究、推廣。

參考文獻

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